Спросить
Войти
-□ □У робот1 проводиться дослгдження ктетики процесу утворення Шун-ного комплексу мж вирусом вШряно1 eicnu Varicella Zoster штаму Oka i ан-титшами до цього вiрусу. Дослгдження проводяться за допомо-гою кантЫеверного сенсорного пристрою
Ключовг слова: канттевер, сенсор,
Varicella Zoster штам Oka
В работе проводится исследование кинетики процесса образования им-мунного комплекса между вирусом ветряной оспы Varicella Zoster штамма Oka и антителами к этому вирусу. Исследования проводятся с помощью кантилеверного сенсорного устройства
In the work the it was investigated the kinetic of process of formation of immune comlex between Varicella Zoster viruses of Oka strain and antibodies. Investigation carried out with the help of cantilever sensor instrument
strain Varicella-Zoster virus -□ □УДК 531.384
ИССЛЕДОВАНИЕ КИНЕТИКИ ОБРАЗОВАНИЯ ИММУННОГО КОМПЛЕКСА
С ПОМОЩЬЮ КАНТИЛЕВЕРНОГО СЕНСОРА
Н.Ю. Гетманенко
Младший научный сотрудник* Контактный тел.: 050-845-45-33 E-mail: getmanenko@gala.net
Н.Н. Рожицкий
Доцент физико-математических наук, проф.* Контактный тел.: 057-702-03-69 E-mail: rzh@kture.kharkov.net
С.С. Черниенко
Студент
*Кафедра "Биомедицинские электронные устройства и
системы"
Харьковский национальный университет радиоэлектроники пр. Ленина, 14, г. Харьков, Украина, 61000 Контактный тел.: 093-747-31-34
Следуя тенденциям полупроводниковой электроники, механические устройства стремительно уменьшают свои размеры и сейчас уже находятся в субмикронной области. Разработанные наномеханические структуры обладают чрезвычайно высокой резонансной частотой собственных колебаний и низкой массой. Дополнительным и важным свойством этих устройств является высокая добротность (Q). Она в настоящее время находится в диапазоне Q ~ 103-105, что значительно выше, чем у электрических колебательных контуров. Этот уникальный набор свойств делает возможным фиксировать с высокой чувствительностью изменение массы при высоких резонансных частотах, что открывает новые области сенсорного применения.
Указанные особенности могут быть использованы при разработке сенсорных устройств, позволяющих определять возбудителей опасных вирусных и инфекционных заболеваний человека.
В настоящее время исследователями ведутся работы по созданию сенсорных устройства на основе кантилеверов на таких возбудителей инфекционных заболеваний как, Aspergillus niger Spores [1], e/coli [2].
Принцип работы сенсорного устройства основан на изменении частоты собственных колебаний кан-тилевера под действием присоединенной массы [3]. При разработке подобных устройств особое внимание следует уделить формированию акцепторного слоя сенсора. В работе [4] предложен метод иммобилизации антител на поверхность кремниевых кантилеверов.
Несмотря на большое количество научных публикаций в мире в области сенсоров на основе кантиле-веров, в отечественных публикациях данная тематика практически не раскрыта. Очевидно, что работы в данной области имеют высокую научную ценность для отечественной науки, т.к. данные устройства позволяют не только детектировать различные вещества, но и в режиме реального времени наблюдать процессы формирования слоев детектируемого вещества на поверхности кантилевера.
В данной работе в качестве анализируемого вещества выступает вирус ветряной оспы Varicella Zoster штамм Oka. Динамические исследования резонансных частот собственных колебаний кантилеверов с иммобилизированными на их поверхности специфическими антителами при образовании специфического комплекса антиген-антитело дают новые данные о протекании процессов формирования иммунного
комплекса и о влиянии на их образование внешних факторов.
Поэтому актуальной научной проблемой является развитие методов образования акцепторных слоев на поверхности кантилеверов на заданные аналиты и разработки сенсорных устройств на основе модифицированных кантилеверов.
Целью данной работы является исследование кинетики образования иммунного комплекса между антителами к вирусу Varicella Zoster и аттенуированным вирусом Varicella zoster штамм Oka с помощью разработанного кантилеверного сенсора. Для достижения поставленной цели в данной работе были решены следующие задачи: был сформирован акцепторный селективный слой на рабочей поверхности кантиле-вера путем иммобилизации на поверхности кремния специфических антител к вирусу Varicella Zoster, исследовано изменение собственное резонансной частоты кантилеверной системы в присутствии аналита во временном интервале.
З.Материалы, оборудования и метод
В работе использовались кантилеверы серии ^С35 производства «М1кгатазЬ» (рис. 1). Характеристики кантилеверов приведены в таблице 1. Работа проводилась с балкой В(табл. 1).
Рис. 1. Кантилевер производства «№Мкгот^Ь> серии NSC35: а — изображение кремниевых кантилеверов, полученное при помощи сканирующего-электронного микроскопа; б — схематическое изображение кремниевого чипа с тремя кантилеверами
Таблица 1
Параметры кантилеверов серии NSC35
NSC35 A B C
Резонансная частота, кГц min 165 240 120
типовая 210 315 150
max 240 405 190
Коэффициент упругости, Н/м min 3.5 6.5 2.5
типовой 7.5 14 4.5
max 12.5 27.5 8.5
Длина, 1±5мкм 110 90 130
Ширина, w±3mkm 35 35 35
Высота, мкм min 1.7 1.7 1.7
типовая 2.0 2.0 2.0
max 2.3 2.3 2.3
В качестве измерительного устройства использовался атомно-силовой микроскоп (АСМ) NT-206 производства ОДО «Микротестмашины» (г. Гомель, Беларусь). Возбуждение колебаний производилось пьезокварцевым генератором, входящим в состав АСМ. Измерение частоты проводилось с помощью оптической системы (рис.2).
При модификации кремниевых кантилеверов использовались следующие материалы: 3-аминопропил-триэтоксисилан АПТЭС Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Buchs, Switzerland), глутаровый альдегид Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Buchs, Switzerland), бидистилли-рованная вода, абсолютированный этанол ГП «Завод химических реактивов» (г. Харьков, Украина), препарат «зостевир», содержащий специфические антитела к вирусу Varicella Zoster, вакцина «окавакс», содержащая живой аттенуированный вирус Varicella zoster штамм Oka в количестве не менее 2000 БОЕ/мл.
Лазер
Рис. 2. Схема измерения частоты собственных колебаний кантилевера
Модификация поверхности кремниевого кантиле-вера проходила в три этапа (рис. 3):
а) отчистка поверхности кантилевера;
б) модификация поверхности путем силанизации кремния с помощью АПТЭС;
в) иммобилизация антител на модифицированной поверхности кремния.
Рис.4. АСМ сканирование поверхности кремния: а — отчищенная поверхность кремния до силанизации (47.8мкм*47.8мкм); б — отчищенная поверхность кремния до силанизации (5.2мкм*5.2мкм); в — силанизированная поверхность кремния (47.8мкм*47.8мкм); б — силанизированная поверхность кремния (2.1мкм*2.1мкм)
Рис. 3. Схема функционализации кантилевера
Очистка кантилеверов проводилось в растворе хромовой смеси в течении 10 мин, затем образец промывался в бидистиллированной воде и высушивался. После чего проводили силанизацию поверхности кремния в 0.1% растворе АПТЭС в абсолютированном этаноле. Результат силанизации контролировался с помощью исследования морфологии поверхности кремния до и после силанизации (рис.4), а также измерением резонансных частот кантилевера до и после силанизации (рис.5).
Рис. 5. Величина резонансной частоты собственных колебаний кантилевера серии ^С35: а — до силанизар ции; б — после силанизации
Строгое выражение зависимости резонансной частоты собственных колебаний кантилевера от массы представлено в [4]. Учитывая то, что в нашем исследовании используются препараты, полученные из сыворотки крови, которые не являются чистыми (в своем составе могут иметь различные группы иммуноглобулинов), для расчета изменения массы можно использовать приближенное выражение, полученное из зависимости [4]:
_33 140 J w
Исходя из полученных данных можно говорить, что прирост массы после силанизации составил 1.406-10-9мкг.
На следующем этапе силанизированный канти-левер помещался в раствор специфических к вирусу Varicella zoster антител. Измерение резонансной частоты проводили через интервалы времени 1 мин, 10 мин, 30 мин, 1ч, 2ч, 4ч, 24ч. Отклонение резонансной частоты обнаружено не было.
Затем кантилевер погружался в раствор содержащий вирус Varicella zoster в концентрациях не менее 1000 БОЕ/мл и 2000 БОЕ/мл. Измерение резонансной частоты проводили каждые 10 сек. до полного прекращения изменения частоты собственных колебаний кантилеверной системы. Результаты исследования представлены ниже (рис. 6).
а х о п Я) CL
Время, с
Рис.6. Зависимость частотного отклика системы на присутствие вируса Varicella zoster от времени при концентрации вируса 1000 БОЕ/мл и 2000 БОЕ/мл
Анализ полученных данных показывает, что этап силанизации поверхности кремния выполнена успешно.
Отсутствие отклика системы при иммобилизации на поверхности сенсора антител, объясняется ультрамалой массой иммуноглобулинов, которая не превышает 150 кДа. В связи с этим становится актуальным вопрос повышения чувствительности сенсорной системы, которая напрямую связана с резонансной частотой собственных колебаний кантилеверов.
Анализируя данные (рис.6) можно сделать вывод о том, что на поверхности сенсора протекает процесс образования специфического комплекса антиген-антитело, сопровождающегося изменением массы резонирующей системы. Таким образом, данное устройство является сенсором на вирус ветряной оспы Varicella Zoster. Общий вид экспериментально полученных зависимостей совпадает с данными полученными различными исследоватеями с помощью поверхност-ного-плазмонного резонанса. Поэтому можно сделать вывод о том, разработанный кантилеверный сенсор может быть использован как альтернатива поверхностному плазмонному резонансу при исследовании кинетики процесса образования комплексов антиген-антитело.
Campbell , G.A, Mutharasan, R. A method of measuring Escherichia coli 0157:H7 at 1 cell/mL in 1 liter sample using antibody functionalized piezoelectricexcited millimetersized cantilever sensor/ G.A. Campbell, R. Mutharasan // Environ Sci Technol.2007. Mar 1.41(5):1668.P.74.
Nugaeva, N. An antibodysensitized microfabricated cantilever for the growth detection of Aspergillus niger spores./ N. Nugaeva, N. et al.// Microsc. Microanal. 2007.13. P.13-17.
Гетманенко Н. Ю. Использование принципа атомносиловой микроскопии при разработке биосенсоров / Н.Ю. Гетманенко// Системы обработки информации. -2011. -4(94)С.218221.
Wasserman, S.R. Structure and reactivity of alkylsiloxane monolayers formedby reaction of alkyltrichlorosilanes on silicon substrates/ S.R. Wasserman, Y.T. Tao, G.M. Whitesides// Langmuir.1989.5.P.1074-1087.
Ekinci K.L. Ultimate limits to inertial mass sensing based upon nanoelectromechanical systems/ K. L. Ekinci, Y. T. Yang, M. L. RoukesE.M. // Journal of applied physics. - 2004. - № 5 (95). - P. 26822689.
